- Wykorzystując technologię Organ-on-a-chip, zbierając dane i tworząc ich kartoteki jesteśmy w stanie powiedzieć kiedy następuje rozwój choroby lub w jakim momencie lek zaczął działać – zauważa dr inż. Agnieszka Żuchowska z Katedry Biotechnologii Medycznej Politechniki Warszawskiej.

Dr Agnieszka Żuchowska jest adiunktem w Katedrze Biotechnologii Medycznej Politechniki Warszawskiej. Odbyła półtoraroczny staż podoktorski w grupie AMBER (Uniwersytet Twente, Holandia). Posiada udokumentowane doświadczenie w zakresie badań biologicznych prowadzonych z wykorzystaniem mikroprzepływowych układów Cell-on-a-chip, Organ-on-a-chip potwierdzone 31 publikacjami.

Jej zainteresowania i wiedza obejmują zastosowanie miniaturowych urządzeń przepływowych w modelowaniu narządów, ich połączeń oraz ich zastosowanie w badaniach przesiewowych leków. Jest ekspertem w zakresie pozyskiwania, wykorzystania i analizy biologicznej kultur przestrzennych sferoid w warunkach normalnych i przepływowych.

Jak można opisać w skrócie technologię Organ-on-a-chip?

Organ-on-a-chip to nowoczesna technologia w dziedzinie bioinżynierii, która umożliwia modelowanie ludzkich organów na mikro skalowanych urządzeniach chipowych. Te niewielkie chipy są zaprojektowane tak, aby naśladować złożoną strukturę i funkcje rzeczywistych organów ludzkich, takich jak serce, płuca, wątroba czy nerki. Są one wykorzystywane głównie do badań biomedycznych, w tym do testowania leków i badania chorób.

Systemy Organ-on-a-chip są wytworzone z biomateriałów, w których znajdują się różnego rodzaju mikrokomory, mikrokanały, w których hodujemy modele komórkowe. Celem jest stworzenie modeli w taki sposób, żeby jak najbardziej odwzorowywały zachowania in vivo, czyli zachowania występujące w organizmie ludzkim. Następnie generujemy w nich warunki przepływowe, czyli takie, które mamy w naszym organizmie.

Dzięki wykorzystaniu technologii Organ-on-a-chip możemy stworzyć każdy stan patologiczny ludzkiego organizmu, i nowotwory, i cukrzycę, choroby sercowe, mózgowe, wątrobowe. Wydaje mi się, że dziś możemy w naszym laboratorium wytworzyć większość stanów chorobowych, jakie znamy.

Czym różni się ona od do tej pory wykorzystywanych narzędzi?

Do tej pory standardowe badania in vitro prowadzone są na hodowlach komórkowych w postaci monowarstwy, czyli komórek płasko rozmieszczonych na płytkach plastikowych. Z taką metodą mamy do czynienia od wieków, jest ona stosowana w większości laboratoriów biologicznych i farmaceutycznych u nas w Polsce. Modele tego typu nie odwzorowują jednak złożoności ludzkiego organizmu. Dlatego złotym standardem są badania prowadzone z udziałem zwierząt. Jednak w tym przypadku pojawiają się problemy różnic fizjologicznych pomiędzy zwierzętami a ludźmi, jak również obawy etyczne. Projektowane i wytwarzane przez nas urządzenia mogłoby z sukcesem zastąpić te badania. W wielu publikacjach naukowych, nie tylko polskich, ale i światowych pokazano, że systemy Organ-on-a-chip dają bardziej wiarygodne wyniki niż modele zwierzęce w przełożeniu na dalsze badania kliniczne prowadzone na ludziach.

W jakim celu wykorzystuje się taką technologię?

Obecnie wszelakie badania biologiczne czy wprowadzania różnego rodzaju substancji terapeutycznych na rynek farmaceutyczny, czy w ogóle jakichkolwiek nowych związków jest prowadzone początkowo na badaniach komórkowych, czyli na hodowlach in vitro, potem przechodzimy przez modele zwierzęce i na końcu są badania kliniczne, które są prowadzone już na ludziach. 

Modele typowo komórkowe mają swoje wady, ponieważ w zupełności nie odwzorowują naszych organizmów ludzkich, są zbytnim ich uproszczeniem. Z kolei modele zwierzęce są żywe, ale oczywiście jest to inny organizm niż organizm ludzki. W tym momencie pojawia się Organ-on-a-chip — połączenie modeli zbudowanych z ludzkich komórek różnego typu, hodowanych w trójwymiarze, o odpowiednim przeskalowaniu w stosunku do ludzkiego organizmu z hodowlą przepływową – imitującą przepływ krwi i limfy, czyli technologii umożliwiającej odwzorowanie ludzkiej fizjologii na wysokim poziomie. Z wykorzystaniem właśnie tych modeli prowadzimy różnego rodzaju badania substancji toksykologicznych, czy nowych leków, ale również odwzorowujemy różne stany patologiczne organów w celu zrozumienia ich mechanizmu i etiologii.

Czym Pani zajmuje się w projekcie tworzonym w katedrze Biotechnologii Medycznej Politechniki Warszawskiej?

Ja głównie zajmuję się projektowaniem tego typu urządzeń, optymalizowaniem wytwarzania w nich różnego rodzaju modeli organowych takich jak wątroba, mózg, nowotwory, a także optymalizowania metody generowania w nich warunków przepływowych. Dodatkowo z wykorzystaniem tych narzędzi prowadzę badania oceny skuteczności działania różnego rodzaju środków terapeutycznych – terapii leczniczych. Ostatecznie moja praca polega także na zbieraniu danych i ich analizie, jak również przekształcaniu tych danych na rzeczywisty wynik.

Jakiego typu dane są zbierane podczas korzystania z Organ-on-a-chip ?

Warto przede wszystkim zauważyć, że to nie są urządzenia, które same zbierają dane czy też badają jakąś próbkę ludzką. Należy pamiętać, że wykorzystując Organ-on-a-chip staramy się odwzorować organ ludzki, który wprowadzamy w jakiś stan patologiczny. To może być nowotwór lub choroby takie jak cukrzyca czy marskość wątroby. Następnie podajemy temu modelowi standardowo wykorzystywane leki w danej chorobie i sprawdzamy poprzez różnorodne sposoby analizy, czy ten organ zmienia się pod kątem morfologicznym i biochemicznym. Analizujemy, czy różnego rodzaju czynniki biologiczne, biochemiczne, które on wydziela — powinien wydzielać, czy i kiedy zachodzi leczenie tego organu bądź dalsze jego uszkodzenie.

Jak wygląda zbieranie takich danych na konkretnym przykładzie?

Załóżmy, że badamy zmianę aktywności metabolicznej komórek budujących wybrany organ. Codziennie badamy tę aktywność metaboliczną, z wykorzystaniem standardowo dostępnych metod bioanalitycznych, a naszym wynikiem jaki otrzymujemy jest np. intensywność fluorescencji. Mając dwa modele, dokonujemy analizy porównawczej. Jedno z urządzeń to standardowa hodowla, gdzie cały czas ten model jest rozwijany, podawane są składniki odżywcze, tworzymy tzw. zdrowy stan takiego modelu. Obok mamy identyczny model, ale bądź wprowadzamy go w stan patologiczny, bądź podajemy mu wybrane związki, których działanie chcemy ocenić np. konkretne leki. 

Następnie w obu modelach sprawdzamy aktywność metaboliczną komórek, po tych dwóch tygodniach. Na koniec zbieramy te dane i porównujemy między sobą z każdego dnia. Dzięki temu możemy sprawdzić, o ile procent aktywność metaboliczna komórek zmieniała się w stosunku do bazowego modelu tzw. kontroli. Takich badań przeprowadzamy dziesiątki, zbieramy te dane w tabele, uśredniamy, prowadzimy analizę statystyczną i ostatecznie uzyskujemy odpowiedź. 

Z pewnością pozyskanych w ten sposób danych są ogromne ilości. Z jakich narzędzi korzystacie, aby móc je we właściwy sposób zebrać, skatalogować?

Tak, to prawda. Podany przeze mnie przykład to tylko jeden z możliwych mierzonych parametrów. Takich parametrów w trakcie pojedynczej hodowli/eksperymentów jest niekiedy 4-6 jednocześnie. Dodatkowo każdy z eksperymentów jest powtarzany minimum 3 krotnie. Zebrane dane grupujemy i analizujemy z wykorzystaniem gotowych programów.

Warto dodać, że poprzez zbieranie danych i tworzenie ich kartotek jesteśmy w stanie powiedzieć, w jakim momencie następuje rozwój choroby, w jakim momencie lek zaczął działać. Dodatkowo jesteśmy w stanie wyciągnąć informację, kiedy np. w przypadku nowotworu rozpoczyna się proces przerzutowania i jakie czynniki na ten proces mają wpływ. Ponadto, poprzez tworzenie połączeń pomiędzy kilkoma organami jesteśmy w stanie wskazać w przypadku przerzutu nowotworowego organ, w którym ten przerzut się pojawi. Z wykorzystaniem technologii Organ-on-a-Chip i zebranych z jej wykorzystaniem baz danych możemy przewidywać, kiedy dany organ wchodzi w konkretny stan patologiczny, a kiedy z niego wychodzi, kiedy następują konkretne zmiany, które badając bezpośrednio w organizmie, nie jesteśmy w stanie stwierdzić.

Czy dane z poszczególnych kartotek można łączyć, tworzyć dzięki temu modele rzadkich chorób?

Tak. Skatalogowane i zebrane dane mogę przynieść nam wiele ważnych i interesujących informacji. Oceniając zmiany wybranych, różnych parametrów jak np. żywotność, zmiany aktywności metabolicznej, ekspresję konkretnych genów czy zmiany stężeń wybranych cytokin, katalogując je a następnie grupując, jesteśmy w stanie wytworzyć tak zwany „odcisk palca”. Oznacza to, że możemy stworzyć charakterystykę danej choroby. Krótko mówiąc możemy stwierdzić, że gdy rozpoczyna się, wspominany wyżej przerzut nowotworowy nasz model wydziela X ilość cytokiny A, jego aktywność metaboliczna jest na poziomie Y, ekspresja genu Z jest na poziomie B.

Czy te dane są zbierane przez jakieś zewnętrzne urządzenia, sensory?

Tak i nie. Analiza modeli Organ-on-a-chip opiera się w największym stopniu na analizie mikroskopowej. Jednak inne parametry wspomniane wyżej jak analiza ekspresji genów czy analiza ilości wybranych cytokin (markerów charakterystycznych dla danego organu/choroby), są oceniane z wykorzystaniem zewnętrznych technik jak RT-PCR, cytometria przepływowa, spektroskopia. Dane generowane są w postaci wyników ilościowych i katalogowane bezpośrednio przez badacza. Oczywiście w urządzeniach Organ-on-a-Chip można zastosować wewnętrzne sensory, zintegrowane w takim urządzeniu. Takie prace są już prezentowane w literaturze zagranicznej, jednak w dalszym ciągu wyniki otrzymane z ich wykorzystaniem nie dają aż tak wiarygodnego odzwierciedlenia jak standardowe metody. Natomiast, ten rodzaj badań jest rozwijany i myślę, że w przeciągu kilku lat będzie to standard w dziedzinie -on-Chip.

Jakie informacje można pozyskać podczas analizy?

Tworząc w tym narzędziu model w stanie patologicznym np. nowotwór, mogę sprawdzić, jak ten nowotwór się zachowuje. Podając odpowiednie czynniki, sprawdzam, czy rośnie, czy zaczynają się przerzuty. Jednocześnie mogę podawać różnego rodzaju leki i sprawdzać ich skuteczność. Także obserwować efekty stężenia leku, częstotliwość jego podania. Tym samym wprowadzam do takiego systemu mnóstwo zmiennych i nie muszę tego badać bezpośrednio na człowieku. Mogę to zrobić poza organizmem, w oddzielnym urządzeniu bez jakiejkolwiek szkody ani dla człowieka, ani dla zwierząt. Warto w tym miejscu zaznaczyć, że jedną z głównych idei wykorzystywania technologii Organ-on-a-chip jest minimalizowanie badań na zwierzętach. 

Z jakich metod analitycznych korzystacie?

Jeśli chodzi o zbierane dane, to materiał biologiczny jest o tyle różnorodny, że możemy prowadzić różnego rodzaju analizy. Najprostszą z nich jest analiza mikroskopowa – mikroskopia fluorescencyjna czy elektronowa. Tu daną będzie zdjęcie, które zrobimy. Na jego podstawie można wychwycić bardzo dużo informacji, co do budowy morfologicznej np. wspomnianego przeze mnie nowotworu. Możemy też sprawdzać żywotność komórek danego modelu. W tym celu możemy wybarwić dany model odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi i ocenić ich intensywność z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej czy też wykonać bezpośredni pomiar z wykorzystaniem spektrofluorymetrów. W badaniach wykorzystujemy również takie techniki analizy jak impedancję, spektrofluorymetrię, RT-PCR czy cytometrię przepływową. Ponadto, możemy wykorzystywać podstawowe techniki bioanalityczne jak np. elektroforeza, Western-Blot czy HPLC-MS. Wszystko zależy od tego co chcemy badać, zmianę jakiego parametru oceniać.

Czy w ramach swojej pracy wykorzystujecie państwo narzędzia data science, sztuczną inteligencję?

Dotychczas bezpośrednio nie wykorzystywaliśmy metod analitycznych z obszaru data science, w tym AI. Jednak podejmowaliśmy próby budowy modelu Organ-on-a-chip z wykorzystaniem modelowania komputerowego, przy współpracy z naukowcami z Politechniki Warszawskiej. Na tą chwilę te działania zostały zawieszone. 

Z czego to wynikało? Czy tego typu technologie są wyzwaniem w pracy nad narzędziami typu organ-on-a-chip?

Myślę, że ogólnie badania biologiczne nie są proste do modelowania matematycznego/cyfrowego. W badaniach tych istnieje tyle czynników i zmiennych, które mają bardzo istotny wpływ na całość eksperymentu, że ich uwzględnienie w tego typu modelu nie jest proste. Jednak pojawia się coraz więcej prób wdrożenia rozwiązań cyfrowych w proces badań biologicznych.  

A czy widzi Pani szansę wykorzystania metod z obszaru data science w przyszłości?

Uważam osobiście, że mają one sens i warto nadal próbować. Jednak do tego potrzebna jest ścisła współpraca naukowców z różnych dziedzin.

Jak taka technologia może wesprzeć badania nad zdrowiem ludzkim?

Najlepszym przełożeniem na organizm ludzki byłoby wykorzystanie komórek biopsyjnych z pacjenta i wyhodowanie ich w naszym narzędziu. To tzw. badania spersonalizowane. Wtedy można byłoby sprawdzić każdy lek, przed podaniem pacjentowi, nie ingerując bezpośrednio w jego organizm. Oczywiście na to potrzeba wiele zgód etycznych i współpracy środowiska lekarskiego.

Na Zachodzie firmy farmaceutyczne same zgłaszają się do biotechnologów, aby za pomocą technologii Organ-on-a-chip tworzyć choroby i badać, z wykorzystaniem tych modeli skuteczność leków. W Polsce to nadal takie laboratoria jak nasze muszą wychodzić z podobnymi propozycjami do biologów, lekarzy czy do grup zajmujących się badaniami leków i szukać zainteresowanych współpracą osób i grup badawczych. Jednak powoli zaczyna się to zmieniać i miejmy nadzieję, że w niedługim czasie badania z wykorzystaniem technologii Organ-on-a-Chip staną się powszechniejszym rodzajem badań in vitro, nie tylko na świecie, ale zwłaszcza w Polsce.